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                                                1. 今天是2019年5月23日 星期四,欢迎光临本站 上海唯地生物技术有限公司 网址: www.rwus.icu

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                                                  文字:[大][中][小] 2016-4-13    浏览?#38382;?b class="red">1320    

                                                  Stable Electroporation-Competent Cell产品说明书




                                                  产品规格(CAT#: DE1080)

                                                  Stable Electroporation-Competent Cell                 50μl/支

                                                  pUC19 (control vector,10pg/μl):                                10μl

                                                  保存条件(保质期):                                         -80℃(6个月)


                                                  基因型

                                                  F' proA+B+ lacIq ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS -mcrBC)

                                                   

                                                  产品说明

                                                  Stable电击感受态细胞只能用于电击转化,不可用于热激转化。Stable菌株是NEB公司开发?#27597;?#36716;化效率菌株,是逆转录病毒/慢病毒载体系统推荐使用的菌株,特别适?#19979;?#30149;毒或具有末端重复序列DNA片段的克隆。基因组含有重组酶recA1 rel A1突变,可有效抑制长片?#25991;?#31471;重复区的重组,降低错误重组?#27597;?#29575;;同时含有核酸酶endA1突变,避免了提取质粒过程中核酸酶的污染,大大提高了高纯度病毒质粒的产量和质量。lacZΔM15的存在使Stable可用于蓝、白斑筛选,?#21496;?#26666;具有四环素和链霉素抗性。唯地生物开发的Stsble电击感受态细胞适用于大质粒的构建或者各种具有末端重复序列?#27597;?#26434;DNA?#30446;?#26500;建,经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率>1×1010 cfu/μg DNA。


                                                  操作方法

                                                  1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降?#38534;?/span>

                                                  2. 取-80℃保存的Stable电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用?#26893;?#25171;EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。

                                                      A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19;

                                                      B. 对于连接产物,请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)或ddH2O重悬,             DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过5 μl/50 μl感受态。

                                                  3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。

                                                  4. 启动电转仪,设置?#38382;篊=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐?#38382;?#20063;可?#27492;?#29992;电转仪推荐的?#38382;?#25805;作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。

                                                  5. 2分钟后取出电击杯,放室温,加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基(室温),用1 ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50 ml离心管(BD Falcon 50 ml锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。倾斜放入摇床,30℃,250 rpm复苏90分钟。

                                                        当质粒中含有不稳定片?#38382;保?/u>30培养可降低错误重组?#27597;?#29575;,若转化control pUC19计算转化效率,则                         37225 rpm复苏60分钟

                                                  6. 5000 rpm离心一分钟?#31449;?#37325;悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的LB平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用?#26412;?5cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于30℃培养箱过夜培养20-24小时。


                                                  注意事项

                                                  1. 对不稳定DNA片段的克隆或逆转录病毒/慢病毒载体的构建,涂板后平板应在30℃培养,以减少发生错误重组?#27597;?#29575;。2. 制备高纯度病毒质粒?#20445;?#24212;使用新鲜转化的平板接菌,新鲜菌液提取质粒,菌液不可低温保存后提取质粒。

                                                  3. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中10分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率。混入目的DNA时应轻柔操作。

                                                  4. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

                                                  5. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。

                                                  6. 当DNA不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染?#20445;?#36716;化效率?#26412;?#19979;降。

                                                  7. 电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流?#31361;?#20809;放电的风险。

                                                  8. 若转化大质粒或想获得?#32454;?#36716;化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

                                                  9. 对于连接产物转化,最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物,保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。

                                                  10. 混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物?#19978;?#24212;减少最终用于涂板的菌量。

                                                  11. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。




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                                                  天津十一选五14期开奖结果

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                                                                                                        1. <div id="0ahg4"><ol id="0ahg4"></ol></div><sup id="0ahg4"><label id="0ahg4"></label></sup>

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                                                                                                          <button id="0ahg4"><ol id="0ahg4"></ol></button>
                                                                                                        2. <dd id="0ahg4"><tr id="0ahg4"></tr></dd>
                                                                                                        3. <button id="0ahg4"></button>
                                                                                                              1. <div id="0ahg4"></div>

                                                                                                                <div id="0ahg4"></div>

                                                                                                                <div id="0ahg4"><tr id="0ahg4"></tr></div>

                                                                                                                          1. <div id="0ahg4"></div>

                                                                                                                                  1. <em id="0ahg4"></em>
                                                                                                                                  2. <em id="0ahg4"><tr id="0ahg4"><mark id="0ahg4"></mark></tr></em>

                                                                                                                                            1. 龙虎和重庆时时彩进群微信 神圣计划app 贵州快3开奖结果公告 福建时时网上购买 上期特平吗杀肖公式 陕西快乐十分走势图一定牛 新疆时时玩法大全 一肖中平特准 黄大仙王中王开奖王 新老时时区别 澳洲幸运10开奖历史记录 推荐一款智能手机 全年公式规律奇门方法出尾 广东时时号码推荐 陕西快乐10分走势电子版 帮别人买重庆时时犯法吗