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                                                1. 今天是2019年5月23日 星期四,欢迎光临本站 上海唯地生物技术有限公司 网址: www.rwus.icu

                                                  新品推荐

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                                                  文字:[大][中][小] 2018-1-2    浏览?#38382;?b class="red">742    

                                                              Y190 Chemically Competent Cell 产品说明书



                                                   

                                                  产品规格 (CAT#: YC1070)

                                                  Y190 Competent Cell:                                         100μl/支              保存: -80℃(3个月)

                                                  pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存:-80℃(12个月)

                                                  Carrier DNA (5 μg/μl)                                              100μl              保存:-20℃(12个月)

                                                  PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存:    4℃(12个月)


                                                  基因型

                                                  MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3112, gal4Δgal80Δcyhr2, LYS2 : : GAL1

                                                  UAS-HIS3TATA-HIS3, MEL1 URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ


                                                  产品说明

                                                  Y190菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株,MATa型,可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为: trp1leu2cyh2报告基因为: lacZ,HIS3MEL1。Y190-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:(pGB和pACT2)或(pGBKT7和pGADT7)。质粒pGB由pGBKT7改造而来,筛选标志为TRP1,用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融?#31995;?#30333;;质粒pACT2与pGADT7的结构和功能类似,筛选标志为LEU,用于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融?#31995;?#30333;。GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域:位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸区段的转?#25216;?#27963;域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS,并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录,但当二者接近?#20445;?#21017;呈现完整的GAL4活性,使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下,BD不与AD结合,将要检测的蛋?#23383;?#20998;别与BD和AD融合,形成 bait融?#31995;?#30333;(bait –BD)和 prey融?#31995;?#30333; (prey-AD),如果 bait和 prey发生相互作用,就会促使 BD和 AD的相互接近,形成完整的GAL4,从而激活报告基因的转录。Y190感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,pGADT7质粒检测转化效率>10cfu/μg DNA。


                                                  操作方法

                                                  1. Carrier DNA 在每?#38382;褂们?#35201;通过加热处理使其变性为单链状态,步骤如下:Carrier DNA 放95℃水浴或金属浴3 min,快速插入冰中,静置3 min,再次放95℃水浴或金属浴3 min,快速插入冰中,静置3 min以上。

                                                  2. 取100 μl冰上融化的Y190感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒0.5-3 μg,Carrier DNA10 μl,PEG/LiAc 500 μl并吸打几次混匀,30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

                                                  3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

                                                  4. 5000 rpm离心 40 s弃上清,ddH2O 400 μl 重悬,离心 30s弃上清。

                                                  5. ddH2O 50 μl重悬,涂板,29℃培养48-96 h。


                                                  注意事项

                                                  1. 感受态细胞最好在冰上融化。

                                                  2. 转化高浓度的质粒?#19978;?#24212;减少最终用于涂板的菌量。

                                                  3. 同时转化2-3种质粒时应增加质粒的用量。

                                                  4. Y190酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。

                                                  5. 菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,?#27426;?#26377;些菌株的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

                                                  6. 酵母在?#27605;?#22521;养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中?#27605;?#25104;分越多,生长越慢,以转化涂板为例?#21644;縔PDA平板29℃,48 h培养可见?#26412;? mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60 h培养可见?#26412;? mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80 h培养可见?#26412;? mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培养可见?#26412;? mm克隆。


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                                                  天津十一选五14期开奖结果

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                                                                                                                <div id="0ahg4"><tr id="0ahg4"></tr></div>

                                                                                                                          1. <div id="0ahg4"></div>

                                                                                                                                  1. <em id="0ahg4"></em>
                                                                                                                                  2. <em id="0ahg4"><tr id="0ahg4"><mark id="0ahg4"></mark></tr></em>